Kryoelektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse
Kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ermöglicht die strukturelle Untersuchung von Makromolekülen bei atomarer Auflösung, welche zur Erforschung der Grundlagen des Lebens erforderlich ist. In den Biowissenschaften hat sie in letzter Zeit große Aufmerksamkeit auf sich gezogen (1, 2) und gilt für die Proteinstrukturbestimmung als Alternative zur Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie. Für diese Technik benötigt man nur eine geringe Probenmenge und sie ist auch für heterogene oder flexible Proteinkomplex- Gemische geeignet. In der Kryo-EM wird die wässrige Proteinprobe zunächst in flüssigem Ethan schockgefroren, so dass die Komplexe idealerweise zufällig orientiert in der Eisschicht vorliegen. Tausende von Partikelbildern werden dann im Elektronenmikroskop digital aufgezeichnet und die dreidimensionale (3D) Struktur des Proteinkomplexes mithilfe leistungsfähiger CPU- oder GPU-Bildverarbeitungsanalysen berechnet. Kürzlich erreichte die Technik die Fähigkeit, einzelne Atome innerhalb eines Proteins zu lokalisieren (3).
Wir verwenden Kryo-Elektronenmikroskopie (EM), um die hochauflösende 3D-Struktur von makromolekularen Komplexen wie AAA + -Proteinen, Redoxproteinkomplexen, Proteasomen oder kleinen Membrankomplexen zu untersuchen. Wir sind besonders an den dynamischen Bewegungen makromolekularer Komplexe während ihrer biologischen Aktivität interessiert und möchten molekulare Filme für diese Nanomaschinen erhalten.
Die Universität Potsdam besitzt ein 200 keV Talos F200C G2 (Thermo Fisher) Elektronenmikroskop, das mit einer Falcon III direktem Elektronendetector und einer Ceta M16-Kamera für das Kryo-EM-Probenscreening und die Datenerfassung ausgestattet ist. Es können zwei Kryo-EM-Halter mit Einzelgrid (ElsaTM, Gatan) oder Mehrfachgrid (Simple Origin) Datensammlungen für bis zu 9 Stunden verwendet werden. Geräte zur Gridvorbereitung wie Glimmentladungseinheiten Zepto (Diener) und Yocto (Diener) sowie der Grid Plunger Leica EM GP 2 (Leica) sind in unserer Facility verfügbar. Die Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Potsdam unterhält einen Rechencluster bestehend aus 3 CPU-basierten Knoten und einem GPU-basierten Knoten, der der Wendler-Gruppe zur Verfügung steht. Darüber hinaus gehören dem Wendler-Labor mehrere kleine Server mit insgesamt 12 High-End-GPU-Karten und 150 TB Speicherkapazität. Wir verwenden die gängigen modernen Kryo-EM-Softwarepakete, die für die Bildverarbeitung und molekulare Modellierung auf unseren Linux-Clustern oder 3D-Grafikmaschinen installiert sind.
Die Buchungsbedingungen für das Mikroskop und die Benutzungsgebühren sind in der Nutzerordnung geregelt. Die Einrichtung steht nur internen Nutzern (Angehörigen der Universität Potsdam) zur Verfügung. Bitte kontaktieren Sie Petra Wendler, wenn Sie Interesse an der Nutzung der EM-Anlage haben.
Proteinreinigung
Wir reinigen makromolekulare Komplexe aus E. coli, S. cerevisiae oder Insektenzellen entweder nach Überexpression heterologer Proteine oder durch Markierung endogener Proteine. Daher verwenden wir alle molekularbiologischen, biophysikalischen und proteinbiochemischen Standardtechniken wie Klonierung, PCR, Immunpräzipitation, Größenausschlusschromatographie, Dichtegradienten, Elektrophorese, Western Blot, Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie. Für Funktionsanalysen in Hefen manipulieren wir deren Genom, damit Gen-Komplementation, Deletionen oder Mutationen analysiert werden können.
Unsere Labore sind mit mehreren Innova Schüttlern für die Kultivierung von Bakterien- oder Hefezellen in großem Maßstab ausgestattet. Das Zellkulturlabor beherbergt verschiedene Eppendorf-Inkubatoren und 2 Herasafe Celan-Bänke. Die Proteinextraktion kann mit einer MM400-Mischmühle (Retsch), einer PM100-Mühle (Retsch) oder einer Aminco French Press durchgeführt werden. Das Labor ist außerdem mit einer Ultrazentrifuge OPTIMA L-100 XP (Beckman) und einem ÄKTA Pure FLPC (G & E) -System ausgestattet. Alle Geräte, die für Standardklonierungstechniken und den Proteinnachweis erforderlich sind, sind im Labor vorhanden.
Weitere Techniken
Im Jahr 2020 haben wir das dynamische In-situ-Lichtstreuungsinstrument Spectrolight 610 (x-tal-Konzepte) angeschafft, mit dem wir die Proteinkomplexhomogenität und den Assemblierungszustand, die ideale Pufferzusammensetzung, die Nanodisc / Protein-Assemblierung, die Langzeitproteinstabilität, die Proteinkristallisationsbedingungen und viele weitere Proteineigenschaften feststellen können.
1: Cressey D, Callaway E (October 2017). "Cryo-electron microscopy wins chemistry Nobel". Nature. 550 (7675): 167. doi:10.1038/nature.2017.22738
2: Kühlbrandt W (2014). “The Resolution Revolution”. Science 343 (6178): 1443-1444. DOI: 10.1126/science.1251652
3. Herzig M A (October 2020). „Cryo-electron microscopy reaches atomic resolution“. Nature. 587, 39-40. DOI: https://doi.org/10.1038/d41586-020-02924-y